Horizon Dx RS (Reference Standard )标准品常见问题汇总

Q-Seq HDx RS

1 什么是Q-Seq HDx 标准品？

答：Q-Seq HDx标准品是通过精准基因编辑具有多种突变位点分子诊断检测标准参照物，可直接应用于各种高通量分子诊断平台,如：NGS, QPCR, ddPCR。其主要用途为评价每次检测突变特异性和灵敏度以灵敏度的精确确认。

2 Q-Seq HDx 标准品是如何制作出来的？

答：通过提取自人的特异性无性繁殖细胞系的gDNA，来源于多种突变类型细胞系的gDNA进行一定比例的混合形成所需要的各种突变体标准品。对于特定位点变异均通过ddPCR的方法进行绝对定量。

对于Q-Seq FFPE HDx标准品，不同细胞系进行混合产生特定的多重突变株，然后进行轻度福尔马林固定，固体石蜡均匀包埋而成，蜡块随后被切成单片型，每片提取DNA量预计≥400ng。

得率取决于FFPE提取方法；我们内部质控用的是Promega’s Maxwell LEV Plus FFPE extraction kit。另外，用于制作标准品的细胞系含有一些内源性突变，这些突变型非常适用于开发含有多种突变的比较大的panel。

3如何理解标准品中的AF等位基因频率？

答：Allelic Frequency 是指含有变异基因的DNA在总的DNA中的比率，你看到我们几乎所有的DNA或者FFPE的AF最高都是50%， 那是因为人类的染色体是双倍体，即是两条染色体，基因编辑的时候是在其中一条染色体上进行编辑，那么最后计算出了的比率就是50%， 也就是说只有一半的DNA是含有这个特定的突变位点的。50%以下的AF是通过和野生型的细胞的混合而来，比如一份50%的突变型细胞和一份野生型细胞混合后，得到的就是25%的AF。

4 Q-Seq HDx 系列产品规格如何？

答：Q-Seq HDx标准品的规格为1ug/管，浓度为50ng/ul; Q-Seq FFPE 标准品单片厚度为15-20um。单片预计提取≥400ng DNA。

5我怎么不能从标准品里检测出某些或者所有预期的突变？

答：如果检测不出突变，或者只能成功检测出野生型，可能是因为引物设计位点在编辑位点之外，而导致突变株无法有效扩增。

为了确保您设计的引物序列包含在突变位点序列之中，可以在每一个产品的详细信息中找到细胞编辑序列信息或者联系我们的技术团队进行索取编辑序列信息。 

Base-Seq HDx RS

1是否提供提取自FFPE切片的的DNA标准品？

答：是，我们很快将推出福尔马林不同程度处理的DNA标准品产品，敬请期待。

2 Base-Seq HDx系列产品规格如何？

答：规格如下：野生型DNA标准品5ug/管；突变型DNA标准品1ug/管，浓度均为50ng/ul。

Base-Seq FFPE 标准品单片厚度为15-20um，单片预计提取≥400ng DNA。

3我的实验对标准品浓度要求为5ng/ul,能对其进行稀释吗？

答：如果您的实验需要浓度为50ng/ul以下，都可以使用适当的缓冲液对标准品进行稀释。gDNA一律使用的是TE缓冲液 [Tris-EDTA (TE) buffer（Tris-HCl 10mM, 1mM EDTA, pH 8.0）]

4 如何使用Base-Seq HDx DNA标准品，通过建立标准曲线来检测平台或实验的检测线(LOD)？

答：不同的平台和实验有不同的检测线（最低灵敏度）。一般来说，sanger测序方法灵敏度为15-25%之间，qPCR的最低灵敏度能达到大约1%，而NGS和ddPCR的灵敏度更高。根据Base-Seq HDx DNA标准品不同的应用类型，LOD的检测线中的等位基因频率也有所不同。制作LOD曲线，至少需要1管突变型DNA和1管野生型DNA标准品。

5 对于Base-Seq FFPE HDx标准品，是否有推荐的提取方法？

答：我们做过FFPE提取方法的比较，实验表明，磁珠法提取能够得到更高得率的DNA。作为内部质控，我们使用 Promega’s Maxwell LEV Plus FFPE 试剂盒来提取，得率可以达到400ng/FFPE以上。同样我们也用过Qiagen’s QIAamp DNA FFPE tissue试剂盒柱式法提取过，发现得率为200~500ng/FFPE,得率稍低一些。

6 如果FFPE提取DNA得率低于预期值，应该如何提高得率？

答：不同操作人员及方法提取DNA得率有很大差异。如果一管FFPE标准品中没有提取DNA或者得率小于50ngDNA,很有可能是因为二甲苯去石蜡化时细胞颗粒丢失随后被洗脱掉。所以在二甲苯处理阶段，务必保证在管子里能够看到细胞颗粒（一小片细胞），在起始阶段细胞没有丢失。

如果提取出来的DNA只有50~200ng/FFPE，有可能是因为洗脱过程中在柱子里有一些残留DNA。建议进行多次洗脱避免残留。以我们的经验来看，两次50ul洗脱液洗脱比一次100ul洗脱液洗脱，DNA得率会更高。

CfDNA HDx RS

1 什么是cfDNA标准品？

答：众所周知，cfDNA（也称为ctDNA）临床应用需要严格的检测流程来确保平台及操作精准度，同时由于体液中ctDNA含量极其微量，使得ctDNA的检测方法还面临着诸多挑战。CtDNA的检测通常需要检测出极低的基因突变频率，0.1%甚至是更低，这也推动这项技术的对检测灵敏度的要求极高。目前使用标准品或者通用对照品来评价cfDNA/ctDNA分析流程受到了不同类型临床样本的极大制约。基于此，Horizon研制的cfDNA标准品系列为ctDNA检测技术提供了一种创新标准化理念，其来源于人类基因编辑细胞系，以片段化的人类基因组DNA（平均大小160bp）方式提供，类似于人类血浆中的肿瘤NDA，由宽泛的突变范围突变型（低至0.1%）以及配对的野生型组成。每个产品有确定的拷贝数浓度以及等位基因频率来满足您不同数量和质量样本的验证。这些产品极大推动了ctDNA检测实验和平台的研发，验证，以及性能评价的标准化。

2 为什么使用cfNDA标准品于我的实验流程？

答：标准品有如下功能：

A 监控实验流程

B 优化和验证实验

C 监测cfDNA分析平台的检测限

D cfDNA分析平台稳定性

F 常规监控实验和平台的性能

G 流程化操作培训

3 Horizon cfDNA标准品和其他肿瘤循环DNA标准品有何区别？

答：cfNDA检测样本是片段化的人类基因组DNA样本，质粒和合成DNA不是理想的对照样本，因为其不能真实的反映人类肿瘤样本的复杂性。因此质粒作为样本得到的结果没有足够的说服力。更多请见。。。

4 Horizon标准品是如何片段化的？

答：突变型gDNA提取自人类基因编辑细胞，并通过机械随机打断方法进行片段化，并且Horizon进一步优化SOP流程来保证批次稳定性。

5打断后是否进行末端修复步骤？

答：Horizon未进行任何的末端处理，但是我们建议用户建库过程中进行此步操作。

6你们是否尝试过其他方法制作此类标准品？

答：Horizon曾经尝试过酶切片段化来制备标准品，但是由于批次间差异导致，这种方法打断的标准品无法满足生产需求，重复性比较低，片段化不稳定，所以我们选择了可操作和稳定性都比较强的机械打断来提高制备可重复性和生产稳定性。

7片段化程度有多大？

答：我们使用片段化分析仪以及D1000 Screen Tape 检测该标准品，下表数据显示cfDNA标准品均能被打断成短片段（达400bp大小），而60%的产品具有类似于肿瘤循环DNA大小的100bp到200bp，并保证每一种规格的产品批次间稳定性。(如下表)

8 cfDNA标准品的质量是如何控制的？

答：每一批次产品进行以下流程质检以确保产品稳定性和精准度。

9 我能用此标准品来做Spike in实验吗？

答：可以。标准品用于支持验证实验流程，同样，也可以作为spike-in标准品来评价cfDNA提取流程。

标准品本身独立使用，但如果有用户利用标准品做spike-in实验，我们建议将标准品掺入到健康人群血浆中。在进行spike-in实验之前，我们建议用户先用我们提供的标准评价一下在特定平台和流程上的表现，而且确定掺入健康人群血浆的标准品的量。与我们提供的标准品相比，掺入后的标准品的突变率会变更低而且更复杂，这是因为正常人群血浆中存在着野生型cfDNA。

10 在做多重分析时，是否存在不同探针之间的竞争？

答：多重检测标准品包括两种非常相近的突变类型：NRAS Q61K和NRAS A59T. 当用多重标准品来检测NRAS A59T时会看到有探针之间的竞争。比如，用2D plot ddPCR平台检测时会发现又多余的量，这可能是因为产生NRAS Q61K的突变的非特异性扩增。

11 我的检测结果与预期结果很不一样，为什么？

答：产品信息提供的是预期的突变频率，Horizon是通过ddPCR检测每一个产品的突变频率。实际检测结果与我们的预期结果不同取决于验证实验的设计，平台和流程，更多问题请咨询: technical@horizondiscovery.com

12 在cfDNA标准品中是否会发现其他突变类型？

答：对于这些标准品的内源性突变的信息，您都可以通过下载每一个产品的原始专利细胞系的全外显子测序结果来获取，或者在每个具体产品的界面链接下载。

13 能否购买其他客户定制的标准品？

答：我们欢迎用户选择产品定制或者购买其他用户定制的产品，但其价格和货期取决于不同案子所需panel的复杂程度，详情请询：info@horizondiscovery.com

14 产品应用文献请见：

https://www.horizondiscovery.com/media/resources/Application%20Notes/reference-standards/Allelic%20Frequency%20Measurement%20of%20Multiplex%20I%20cfDNA%20Reference%20Standard%20Set%20using%20Droplet%20DigitalTMPCR,%20Ion%20TorrentTMand%20MiSeqTM.pdf