网友提出两个关于定量PCR的问题：

　　1.在同一个反应板上，检测同一个基因，但是样本的起始量不同，比如有的样本是1个细胞，另外一个是10个细胞，对于这种情况，基线的确定是统一，还是对于不同起始量采用不同的基线?

　　2. 在罗氏的仪器中，往往采用3到15循环标准偏差10倍作为阈值，为什么取10倍?

　　现不揣浅陋，作答如下。不当之处，欢迎各路大神切磋指教。

　　1、在同一块反应板上，不同浓度的模板DNA进行定量PCR，其CT值不一样，基线的长短也不同，有的长，有的短。典型的情况如下图：

　　如果最短的基线长度也有10个循环左右，则所有扩增曲线采用同样的基线，都选用最短的基线以照顾到所有的扩增曲线。比如上图的8组反应，可以把基线范围统一设定为循环1-8，而不必单独把第8组反应的基线设为循环1-32。

　　如果有个别样本浓度太高，导致其基线长度太短，不足以统计本底信号的标准偏差，则建议把该样本稀释10倍或100倍，重新进行定量PCR，使其基线长度增加3个循环或者6个循环，以求准确测定基因拷贝数。

　　2、取10倍标准偏差是一个经验值，没有理论依据，目的是确保信号与背景噪音有足够的区分度，避免假阳性。

　　如果被检验的样本所产生的荧光信号非常强，则当然选取倍数越高越好。但是倍数越高，存在越多把弱信号当成噪音给错误地过滤掉、造成假阴性的风险。

　　综合权衡假阳性和假阴性的可能性，10倍是一个在正常实验条件下能够照顾到双方的最佳平衡点，所以大多数定量PCR检验都选定10倍SD作为确定阈值的依据。