TwistDx公司RPA恒温扩增技术被誉为DNA诊断领域的革命性创新
作者：moreybio 发布时间：2017-04-06 点击次数：9804
英国TwistDx公司(前身为ASM科技有限公司)成立于1999年，基于英国剑桥Babraham研究院建立的生物技术公司。该公司通过突破等温DNA扩增，开发的重组酶聚合酶扩增专利技术(RPA),被誉为DNA诊断领域的革命性创新。(http://www.twistdx.co.uk)
What is RPA?
概念：重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37°C左右。
重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。
Who uses RPA?
以此为基础的TwistAmp® 核酸扩增产品，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。
产品名称 | 货号 | 规格 | 储存 | 检测方法 |
TwistAmp Basic | TABAS03KIT | 96次 | -20℃ | 终点检测：如凝胶电泳 |
产品名称 | 货号 | 规格 | 储存 | 检测方法 |
TwistAmp exo | TAEXO02KIT | 96次 | -20℃ | 实时荧光定量检测 |
产品名称 | 货号 | 规格 | 储存 | 检测方法 |
TwistAmp nfo | TANFO02KIT | 96次 | -20℃ | 测流层析试纸检测 |
RPA技术有哪些特性:
RPA的特性：快速检测 15min进行单分子检测试验， 简易包装 稳定冻干形式试剂. 无需热循环过程 摆脱任何仪器束缚. 便携 设备要求低，贫瘠条件亦能 完成检测
RPA能实现多重化吗
可以。RPA技术支持在同一个管中同时进行多个扩增反应。不过，多重化的引物组合需要精心设计，以便每个引物都能同样有效的工作。需要注意的是，RPA反应的引物总量(nmol)最好不要超标太多。如果在一个反应中使用两个以上的扩增引物，就应该控制不同引物的量。另外，我们应当事先考虑好检测多个扩增事件的探针、设备以及荧光团的兼容性。
能否对模板进行定量
可以。扩增子达到可检出水平的时间，依赖于反应起始时的模板量。初始模板的拷贝越多，扩增子就越快达到可检出水平。不过，这种定量需要精心的实验安排，确保对照反应是同时开始的。举例来说，可以利用镁离子的添加时间进行控制。因为镁离子一旦进入体系，RPA反应就会开始。
此外，较慢的扩增过程有助于更精确的定量。我们可以通过调整反应条件或引物设计来减慢RPA的反应速度。
能否进行荧光终点分析
可以。这样比较的是反应开始时的荧光和反应结束时的荧光，荧光增强意味着发生了扩增。
能否支持生物素或荧光标记的寡核苷酸
支持。在RPA反应中，连有生物素或荧光团的引物与未修饰的引物表现差不多。据悉还没有发现任何差异。
跑胶前需要回收RPA产物吗
需要。RPA反应中的物质会干扰琼脂糖电泳，如果不进行产物回收，跑出来的带会出现拖尾。
恒温扩增技术
取代PCR的核酸扩增术 ，
领域：广泛应用于临床诊断，食品安全检测，动物疾病检测等领域
特点：快速，高效，特异，无需专门设备
RPA与LAMP对比
LAMP:环介导等温扩增法的特征是针对目标DNA链上的六个区段设计四个不同的引物然后再利用链置换反应在一定温度下进行反应。反应只需要把基因模板、引物、链置换型DNA合成酶、基质等共同置于一定温度下(60～65℃)、经一个步骤即可完成。
RPA：主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。
重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。
LAMP | RPA | ||
开发公司 | 日本荣研生物 | 英国TwistDx | —— |
酶组分 | 链置换DNA聚合酶 | 重组酶;单链结合蛋白;链置换DNA聚合酶 | —— |
最适反应温度 | 60-65℃ | 37-40℃ | Win! |
反应时间 | 40min左右 | 15min左右 | Win! |
引物数 | 2对 | 1对 | Win! |
状态 | 液体 | 冻干 | Win! |
检测方式 | 目视;比浊检测 | 电泳;测流试纸;探针法荧光定量 | —— |
可否用于下游应用 | 否 | 否 | —— |
仪器 | 水浴锅或恒温箱 | 无需任何仪器 | Win! |
国产化，价格低 | 价格相对较高 | —— | |
硬性缺点 | 气溶胶，假阳性 | 终端检测相对复杂，价格高 | —— |
新一代RPA恒温扩增荧光检测仪T8
新一代RPA恒温扩增荧光检测仪T8--敏如红隼
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T8 等温仪介绍：
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2、强效的FAM?和ROX?通道作为标准
3、精确且实时的屏幕输出
4、自动磁力混匀
5、无需电脑
详情请见：http://www.twistdx.com.cn/products/yqhc/64.html
可选配件（需另购）：外部电源(http://www.twistdx.com.cn/products/yqhc/65.html)，手提箱(http://www.twistdx.com.cn/products/yqhc/66.html)
RPA核酸检测系列之RPA最新应用
RPA核酸检测系列之RPA最新应用
RPA核酸检测系列之RPA最新应用：
犬内脏利什曼病POCT检测
A Novel Molecular Test to Diagnose Canine Visceral Leishmaniasis at the Point of Care
A Castellanos-Gonzalez, O.A. Saldarriaga, L. Tartaglino, R. Gacek, E. Temple, H. Sparks, P. C. Melby, B.L Travi
Prduct used：TwistAmp nfo kit
Paper Link：
 |
RPA用于全基因组和基因特异性DNA甲基化检测
Colorimetric detection of both total genomic and loci-specific DNA methylation from limited DNA inputs
Eugene J.H. Wee, Thu Ha Ngo, Matt Trau
Prduct used：TwistAmp basic kit
Paper Link：
埃及血吸虫病RPA扩增及寡色谱测流试纸检测
Isothermal Recombinase Polymerase amplification (RPA) of Schistosoma haematobium DNA and oligochromatographic lateral flow detection
A. Rosser, D. Rollinson, M. Forrest, B. L Webster
Prduct used：TwistAmp basic kit；TwistAmp nfo kit
Paper Link：
更多RPA相关应用请见：
产品详情：
货号 | 产品名称 | 描述 |
TABAS03kit | TwistAmp Basic | 用于RPA快速扩增 |
TABSRT01KIT | TwistAmp Basic RT | 用于逆转录反应，CDNA快速扩增 |
TANFO02_T | TwistAmp nfo | 用于末端检测，检测DNA复制反应 |
TAFPG01kit_T | TwistAmp fpg | 用于real-time探针检测 |
TAEXO02kit_T | TwistAmp exo | 用于real-time探针检测 |
TAEXORT02kit_T | TwistAmp exo RT* | 荧光检测探针法RT-RPA |
TAUST01kit | TwistAmp exo +Listeriam | 用于李斯特菌检测 |
TAEXOCAMP01KIT | TwistAmp exo +Campylobacter | 用于弯曲菌检测 |
TFSAL01KIT_T | TwistFlow Salmonella | 用于沙门螺杆菌检测 |
TGSAL01KIT_T | TwistGlow Salmonella | 用于沙门螺杆菌检测 |
TFRED01KIT_T | TwistFlow RedSnapper | 用于红鲷鱼基因检测 |
