液态重组酶聚合酶扩增 (RPA) 试剂正式上市

近期，TwistDx推出了一系列全新的液态重组酶聚合酶扩增 (RPA)试剂盒，这些试剂盒非常适合需要不使用热循环仪就能在15分钟内完成 DNA/RNA 扩增的实验室以及想要灵活构建试验体系的研究人员使用。

TwistAmp® Liquid试剂盒提供经甘油稳定化处理的液态RPA试剂，该形态对于在实验室执行 PCR 和其他基于酶的反应的任何人来说都非常熟悉。这些试剂各自装于单独的试管中，用户可随意从中移取任何量的酶混合液来构建自己所选的RPA反应体积，配制用于多次反应的预混液，或者以各种 RPA 组分比例进行实验以优化试验。

除了具有室温稳定性的冻干态TwistAmp® RPA试剂盒这一旗舰产品，本次新推出的 TwistAmp® Liquid试剂盒是现场或定点试验开发的理想之选。液体形态让实验室更容易地在日常工作中使用快速简单的RPA法（该方法有时甚至采用与PCR相同的引物）取代 PCR法，以及更容易地开发出定制的试验。

产品组成:

相关扩展试剂盒额外提供试剂:

v 100 µl 50x 外切酶 III (TwistAmp® Liquid exo/exo RT kits);

v 100 µl 50x 逆转录酶 (RT) (TwistAmp® Liquid Basic RT/exo RT kits);

v 100 µl of 阳性对照模板 (DNA with TwistAmp® Liquid exo/Basic kits, RNA with TwistAmp® Liquid Basic RT/exo RT kits);

v 45 µl of 阳性oligo mix (oligo mix consists of primers for Basic/Basic RT kits, primers plus a fluorescently labelled exo probe in the exo/exo RT kits)

其他必需试剂(非试剂盒提供):

v ddH2O; dNTPs; 寡聚核苷酸; RNase抑制剂(仅用于RT试剂盒)

产品信息:

附: TwistAmp liquid试剂盒Q&A

Q 20x核心反应mix有沉淀,是否影响其功能?

A在低温保存时, 重组酶和辅助蛋白在50%甘油中20x核心反应mix中有时会发生可逆的共沉淀反应.所以在室温融化混匀后离心使其返回溶液形式并不影响其功能。

Q 使用Liquid试剂盒做多重实验，能否制备master mix?

A 可以。Oligos, 2x Reaction Buffer, water, dNTPs and 10x E-mix可以预先混合，置于冰上几个小时，在很多实例中可以过夜保存（性能上有任何改变都需要客户自行实验和评价）。一旦加入20x核心酶，短期保存在冰上也是可以的。

Q 使用Liquid试剂盒如何提高重复率和RNA模板的扩增率?

A 先将RNA模板和醋酸镁混合后加入反应体系中，RNA的三级结构会抑制逆转录酶的活性，所以加入RNA和醋酸镁时，将两者分别加到在管内壁两侧或者将醋酸酶加在管内盖中，同时离心混入体系，这种操作会提高反应性能。

Q 在TwistAmp Liquid E-mix中有沉淀，还能使用吗?

A 可以。少量磷酸肌酸会发生沉淀不会影响RPA反应，只需在实验前通过涡旋将沉淀重悬离心即可。

Q 在使用Liquid试剂盒时，是否能够使用dUTP/生物素（酰）化dUTP?

A 可以，请参考

http://dx.doi.org/10.7150/thno.15250 和 http://dx.doi.org/10.1186/s13148-015-0100-6

Q 最小的RPA液体反应体系是多少?

A 最小低至PL级，请参考

 http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0153359

Q 液体反应体系中需要加入多少dNTPs?

A 1.8mM(总)dNTPs 作为起始量即可。用户也可以根据自身实验优化浓度,有时1-12mM均适用。

Q 如何提高扩增曲线的可重复性?

A 优化扩增曲线考虑以下因素: 对于低拷贝数模板，不稳定扩增可能是因为达到检测限或者是反应混匀程度不同（未混匀的反应扩增效率不佳）。另外，在低温情况下存贮，重组酶和辅助蛋白在50%甘油情况下形成沉淀,也是可能导致不稳定扩增的原因。所以，20x核心反应mix在室温下解冻并震荡涡旋将使其成为液体，不影响其功能,并且有效提高扩增效率。不稳定扩增也可能是因为master mix量不足，在加入体系前，用户必须保证震荡后20x核心反应组分均一。