近日，知名华人科学家张锋教授与同事在《科学》杂志上发表论文，介绍了一种全新的CRISPR应用工具，用以检测核酸。他和James Collins教授团队，联合将CRISPR-Cas13a改造成了灵敏度达到了阿摩尔级（aM，10的负18次方摩尔每升），可以检测单分子的SHERLOCK技术。这一工具能快速检测RNA或DNA分子，灵敏度甚至有望检测出单个核酸，这一重磅研究对于科研与全球公共卫生有着极大的影响，该事件很快在生物圈内刷屏了。
就在大家在为张锋大神欢呼雀跃，在为CRISPR-Cas13a叫好的时候。我们发现，让SHERLOCK技术达到阿摩尔级灵敏度的不是CRISPR-Cas13a，是它的搭档，另一个颠覆性的发明重组聚合酶扩增技术（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）。很少有报道提起她，她就那样默默站在CRISPR-Cas13a背后。
RPA有多厉害？据说可以媲美PCR技术。什么是PCR？著名发明家Kary Mullis因为发明这个技术于1993年获得诺贝尔奖。RPA技术被称为是可以替代PCR的核酸检测技术（由英国公司TwistDx Inc开发）。以此为基础的TwistAmp® 核酸扩增产品，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。如果张锋和Collins教授的这项发明最终能造福人类，我们也应该记住RPA的发明人。
常规的PCR也可以扩增特定DNA片段，提高灵敏度，但是PCR对温度的控制有很复杂的要求，要经历高温变性、低温复性还有中温延伸三个步骤。RPA就不需要这么麻烦，它的反应需要三种在常温下有活性的酶，最适温度在37-42℃之间，不需要变性过程，这样就大大加快了扩增的速度。再加上不需要温控设备，两者共同打造了真正便携式的快速DNA扩增技术。
不仅方便快捷，RPA更“迷人”的地方在于扩增量十分高，能够将痕量的核酸（尤其是DNA）模板扩增到能够可以检测到的水平。痕量，顾名思义就是“该物质虽然存在，但只有‘痕迹’，无法用一般方法定量检测，通常含量＜0.1mg”，所以大家就知道RPA有多厉害了吧？利用它可以从单分子得到大约1012的扩增产物。而且RPA还不需要复杂的样品处理，及时环境限制，无法提取核酸，也难不倒它[4]。
利用RPA，在室温中，样品中DNA或RNA的含量就可以得到提升，一旦含量增加了，再将DNA转化为RNA。如此，Cas13a就有资格进化成“SHERLOCK”了！
RPA技术答疑
▲RPA技术有哪些特性？
RPA的特性：快速检测 15min进行单分子检测试验， 简易包装 稳定冻干形式试剂. 无需热循环过程 摆脱任何仪器束缚. 便携 设备要求低，贫瘠条件亦能 完成检测
▲RPA能实现多重化吗？
可以。RPA技术支持在同一个管中同时进行多个扩增反应。不过，多重化的引物组合需要精心设计，以便每个引物都能同样有效的工作。需要注意的是，RPA反应的引物总量(nmol)最好不要超标太多。如果在一个反应中使用两个以上的扩增引物，就应该控制不同引物的量。另外，我们应当事先考虑好检测多个扩增事件的探针、设备以及荧光团的兼容性。
▲能否对模板进行定量？
可以。扩增子达到可检出水平的时间，依赖于反应起始时的模板量。初始模板的拷贝越多，扩增子就越快达到可检出水平。不过，这种定量需要精心的实验安排，确保对照反应是同时开始的。举例来说，可以利用镁离子的添加时间进行控制。因为镁离子一旦进入体系，RPA反应就会开始。
此外，较慢的扩增过程有助于更精确的定量。我们可以通过调整反应条件或引物设计来减慢RPA的反应速度。
▲能否进行荧光终点分析？
可以。这样比较的是反应开始时的荧光和反应结束时的荧光，荧光增强意味着发生了扩增。
▲能否支持生物素或荧光标记的寡核苷酸？
支持。在RPA反应中，连有生物素或荧光团的引物与未修饰的引物表现差不多。据悉还没有发现任何差异。
▲跑胶前需要回收RPA产物吗？
需要。RPA反应中的物质会干扰琼脂糖电泳，如果不进行产物回收，跑出来的带会出现拖尾。
RPA核酸检测系列最新应用
犬内脏利什曼病POCT检测 A Novel Molecular Test to Diagnose Canine Visceral Leishmaniasis at the Point of Care A Castellanos-Gonzalez, O.A. Saldarriaga, L. Tartaglino, R. Gacek, E. Temple, H. Sparks, P. C. Melby, B.L Travi Prduct used：TwistAmp nfo kit Paper Link： http://www.ajtmh.org/content/early/2015/07/30/ajtmh.15-0145.abstract
RPA用于全基因组和基因特异性DNA甲基化检测 Colorimetric detection of both total genomic and loci-specific DNA methylation from limited DNA inputs Eugene J.H. Wee, Thu Ha Ngo, Matt Trau Prduct used：TwistAmp basic kit Paper Link： http://www.clinicalepigeneticsjournal.com/content/7/1/65 埃及血吸虫病RPA扩增及寡色谱测流试纸检测 Isothermal Recombinase Polymerase amplification (RPA) of Schistosoma haematobium DNA and oligochromatographic lateral flow detection A. Rosser, D. Rollinson, M. Forrest, B. L Webster Prduct used：TwistAmp basic kit；TwistAmp nfo kit Paper Link： http://www.parasitesandvectors.com/content/pdf/s13071-015-1055-3.pdf
